دستگاه PCR

همه چیز درباره PCR

اطلاعات اولیه

این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.

لطفا به ادامه مطلب مراجعه نمایید...

همه چیز درباره PCR

اطلاعات اولیه

این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.

PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.

تاریخچه

در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود.

مراحل PCR

·         مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30S) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.

·         مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود. ما بین دو پرایمر ساخته می‌شود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30S در دمای 65 - 30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.

·         مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.

ادامه PCR بعد از چرخه اول

بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه ، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است.

کاربردهای مهم PCR

·         تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.

·         بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.

·         تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.

·         تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.

تشخیص بیماریها

کشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟

مشکل PCR و راه حل آن

اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.

یکی از روش‌های پیشنهادی انجام PCR داخلی یا Nestied PCR است. از این روش با استفاده از دو پرایمر قطعه‌ای از DNA را تکثیر می‌دهند و سپس قطعه‌ای دیگر در داخل DNA‌های تکثیر شده PCR می‌شود. بدین صورت احتمال آلودگی کاهش می‌یابد.

روش‌های تغییریافته ‏PCR‏ و کاربرد این روش‌ها در شناسایی و درمان

واکنش زنجیره‌های پلیمراز (‏PCR‏) روشی است برای تکثیر اختصاصی قطعات ‏DNA‏ که نخستین بار در سال 1985 گزارش شد. در این روش قطعه‌ای از ‏DNA‏ به طور انتخابی با به‌کارگیری دو پرایمر اولیگونوکلوئوتیدی و آنزیم پلیمراز ‏Tag‏ می‌توان تا ده هزار برابر تکثیر کرد. هریک از این دو پرایمر به رشته‌های مخالفشان در روی ‏DNA‏ هدف متصل شده و مکان آنها به‌گونه‌ای است که سنتز زنجیره ‏DNA‏ توسط آنزیم پلیمراز تنها در میان دو پرایمر انجام می‌گیرد.

 ‏
از آنجا که زنجیره‌های تازه ساخته شده خود مکمل پرایمرها است، این چرخه می‌تواند پس از یک مرحله واسرشته شدن زنجیره‌های ‏DNA‏ از هم تکرار شود. به عبارتی ‏PCR‏ روشی است برای یک برنامه دوره‌ای مشتمل برای تکرار گرم و سرد کردن و ‏DNA‏ به‌کمک یک آنزیم ‏DNA‏ پلیمراز مقاوم به گرما و یک جفت پرایمر تحت تکثیر انتخابی قرار می‌گیرد و از طریق این روش ‏DNA‏ به صورت تصاعد هندسی زیاد می‌شود. امروزه روش ‏PCR‏ جایگاه بسیار مهمی را در جنبه‌های مختلف مهندسی ژنتیک، بیولوژی مولکولی، میکروب‌شناسی تشخیصی تشخیص سرطان و بیماری‌های ژنتیک، تشخیص هویت، جرم شناسی (پزشکی قانونی جهت تشخیص منشأ نمونه اسپرم، خون و ...) تعیین ترادف، باستان‌شناسی، مطالعات تکاملی موجودات و ... پیدا کرده است. کاربرد بیشتر و دقیق‌تر تکنیک ‏PCR‏ در تشخیص، روش‌های تغییر یافته‌ای از آن به وجود آمده است که به تعدادی از آنها اشاره می‌شود.

مالتیپلکس پی سی آر (‏Multiplex-PCR‏)‏
‏ یکی از روش‌های تغییریافته ‏PCR‏ است که در آن تنها یک جایگاه ژنی مورد بررسی قرار می‌گیرد، با استفاده از پرایمرهای مختلف می‌توان چندین جایگاه را مورد بررسی قرار داد و از چندین جفت پرایمر اختصاصی جهت تکثیر استفاده می‌شود. کاربردهای این روش می‌تواند شامل موارد زیر باشد: ‏
‏1) بخش‌های بزرگی از یک ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوی تغییرات می‌تواند بررسی شود. برای مثال کشف نقص‌ها در بیماری دیستروفی عضلانی روشن یا کشف بخش‌های مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مایکروباکتریوم توبر کلوزیس عامل بیماری سل، ‏
‏2) بخش‌های غیرمربوط به هم در ژنوم هدف می‌تواند مورد آزمایش واقع شود و‏
‏3) می‌توان از طریق این روش با پرایمرهای مختلف به جست‌وجوی عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسایی عوامل شایع مننژیت. این روش بیشتر برای شناسایی جایگاه‌هایی از ژن‌ها به کار می‌رود که انواع زیادی از جهش در آنها به وقوع می‌پیوندد.‏

آرتی-پی‌سی آر (‏RT-PCR‏)‏
‏ این روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداری معکوس نیز معروف است که ماده اولیه در آن ‏RNA‏ است. اولین مرحله در این روش تبدیل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ (‏DNAای که مکمل توایس‌های ‏mRNA‏ است) توسط آنزیم نسخه‌بردار معکوس صورت می‌گیرد (‏RT‏). برخی از موجودات مانند برخی از ویروس‌های ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضی از ویروس‌ها مانند ویروس هپاتیت ‏B‏ هرگز به شکل ‏DNA‏ مابین  در اثر آنزیم نسخه‌بردار معکوس درنمی‌آید. آنزیم نسخه‌بردار معکوس (‏RT‏) در این روش از  "‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏" و "‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ " به‌دست آمد.
کاربرد این آنزیم به‌دلیل آن‌که آنزیم به حرارت حساس بود در ابتدا پایین بود ولی با کشف باکتری به نام "ترموس ترموفیلوس" یک ‏DNA‏ پلیمر از مقاوم به نام (‏Tth‏) بهبود یافت که در حضور یون ‏Mn+2‎‏ دارای فعالیت نسخه‌برداری معکوس است و در دمای 72 درجه سانتیگراد توسط این آنزیم از روی ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته می‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافی توسط اتیلن گلیکول تترااستیک اسدی (‏EGTA‏) حذف می‌شود و سپس این آنزیم از ‏DNAای که خود ساخته استفاده و آن را تکثیر می‌کند.‏

آرمز پی‌سی‌آر (‏ARMS-PCR‏)‏
‏ این روش تکثیری قدرتمند برای مشخص کردن جهش‌های نقطه‌ای است. در این روش از پرایمرهای جهش یافته و طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می‌شود. اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است و اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله‌ حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است. این روش نام‌های دیگری نیز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏. ‏

نستد پی‌سی‌آر (‏Nested-PCR‏)
در این روش از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود، طوری که جفت دوم در بنی جفت اول جای می‌گیرد. در این روش ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف در طول 30-15 چرخه تکثیر می‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف کوچکتری از ‏DNA‏ که درون ‏PCR‏ اولی است، به اندازه 40-15 چرخه تکثیر می‌شود.‏
مزایای این روش تغییر یافته ‏PCR‏ عبارت است از: 1) نیاز به پروب (کاوشگر) و تأییدهای بعدی کمتر است، 2) حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است و 3) به دلیل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جدید، ممانعت کننده‌ها رقیق می‌شود. این روش در تعیین جنسیت جنین در سه ماهه اول بارداری استفاده شده و از این طریق توانسته‌اند بیماری‌های وابسته به جنس را تعیین کرده و از تولد کودکان بیمار جلوگیری کنند.‏
همچنین ویروس "سیتومگالوویدوس" که می‌تواند سبب ناشنوایی در 1% از کودکان شود، توسط این روش تشخیص داده شده و امکان درمان زودهنگام از این طریق امکان‌پذیر است. جنین‌های مبتلا به سندروم داون نیز در مرحله بارداری مادر با این روش تشخیص داده شدند.

 ‏Real-Time PCR
‏ به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری که اجازه پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را می‌دهد، این روش ابداع شد. در این روش از کاوشگرها یا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای 5 یا 3 استفاده می‌شود. که امکان پایش پیوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازی آنها در روش‌های الکتروفورز در ژل آگاروز یا ژل پلی آکریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال 1992 کشف شد. این روش به دلیل کاهش زمان سیلک‌های ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و کاربرد نشانگرهای فلوروژنیک و روش‌های حساس آشکارسازی تابش آنها باعث افزایش سرعت این سیستم نسبت به سیستم ‏PCR‏ معمولی شده است. سازندگان و کاربران این روش سعی می‌کنند محصول ‏PCR‏ کوچک‌تر طراحی کنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهینه نمی‌کند. البته این روش دارای معایبی نیز است از جمله می‌توان به عدم ناتوانی در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم‌ها با شیمی برخی رنگ‌های فلورژنیک اشاره کرد. برای شناسایی بسیاری از ویروس‌های عامل بیماری‌های انسان از این روش استفاده شده است. ‏